iElisa β-兴奋剂检测试剂盒

1. 概要 β-兴奋剂（也称瘦肉精）主要包括克伦特罗和 沙丁胺醇，是一种肾上腺受体激动剂，即神经兴奋 剂，化学性质上类似苯乙醇胺的衍生物。此类药品 在临床上用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺 气肿等疾病。因该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉 积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖 促进剂非法使用。人食用了饲喂 β-兴奋剂作为添加 剂的动物所生产的畜产品后，由于畜产品中残留的 β-兴奋剂会引起中毒，通常会出现肌肉震颤、心悸、 精神紧张、头疼、肌肉疼痛、晕眩、恶心、呕吐、 发烧、颤栗等症状，对消费者的健康构成极大危害。 因此，世界许多国家禁止在饲料中使用 β-兴奋剂来 增加动物的瘦肉率。 2. 原理 本产品是利用免疫竞争法检测原理建立的一 种定量检测试剂盒。该试剂盒对克伦特罗的交叉反 应 100%，对沙丁胺醇的交叉反应 110%，所以 β- 兴奋剂试剂盒可以对动物组织、饲料和尿液等中克 伦特罗和沙丁胺醇的残留进行定量检测。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有二抗的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔） 2) 标准品：0 ng/mL 、0.1ng/mL、0.5ng/mL、 2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0 ng/； 1 瓶 × 1.0mL 3) 抗体： 1 瓶 × 10mL 4) 酶标抗原： 1 瓶 × 10mL 5) 10×洗涤浓缩液： 1 瓶 × 50mL 6) 10×复溶浓缩液： 1 瓶 × 16mL 7) 稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50mL 8) 稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50mL 9) 显色底物： 1 瓶 ×18mL 10) 终止液： 1 瓶 × 7mL 11) 11）试剂盒说明书: 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μL-200μL 单道，100μL-1000μL 单道, 50μL-300μL 八道 —涡旋混合器 —酶标板振荡器 —多功能旋转振荡器 —离心机 —氮吹仪 —计时器 —50mL 和 10mL 离心管 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —甲醇 —正己烷 —无水硫酸钠 —蒸馏水 —盐酸 —氢氧化钠 —乙腈 5. 工作溶液的配制 1) 洗涤液的配制： 根据实验所需的量用纯水将 10 倍洗涤浓缩液稀释 10 倍后使用。（例如：取 10 mL 浓缩液+90 mL 纯水, 可以用于 32 孔的 检测）。 2) 复溶液的配制（肌肉、肝脏、肾脏样品用）： 根据实验所需的量用纯水将 10 倍复溶浓缩液 稀释 10 倍后使用。（例如：取 2mL 浓缩液+18 mL 纯水）。 3) 1.0mol/ L 盐酸提取液的配制（饲料样品用）: 取 10mL 浓盐酸，置于 110mL 纯水中，混匀。 4) 0.1mol/ L 氢氧化钠溶液的配制（饲料样品用）: 取 4.0g NaOH 加纯水定容至 100.0mL。 5) 0.2mol/ L 氢氧化钠溶液的配制（猪毛样品用）: 取 8.0g NaOH 加纯水定容至 100.0mL。 6. 样品处理 6.1 尿样 1) 取尿样，4000r/min 离心 10min； 2) 取上清液 100μL，用 300μL 稀释缓冲液 A 稀释， 混匀、取 50μL 用于检测。 稀释倍数：4。

6.2 肌肉、肝脏、肾脏： 1) 去除肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪部分； 2) 取4.0g均质样品于50mL离心管中，加入8.0mL 乙腈样品提取液，多功能旋转振荡器振荡提取 30 分钟； 3) 室温下 4000r/min 离心 10min，移取上清液 4.0mL 到另一试管中，氮吹仪吹干； 4) 用 1.0mL 复溶液复溶，向试管中加入 2.0mL 正己烷，涡漩混匀 30 秒，4000r/min 离心 10 分钟； 5) 取 100μL 下层样品提取液，用 400μL 稀释缓冲 液 B 稀释，混匀、取 50μL 用于检测。 稀释倍数：2.5 6.3 饲料原料 1) 称取2.0g粉碎样品于50mL离心管中，加2.0mL 1.0mol/L 盐酸提取液及 18mL 纯水，混合均匀， 用多功能旋转振荡器振荡提取 10min。 2) 4000r/min 离心 10min。 3) 取上清加入 0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 到 7.0-8.0。混合后 4000r/min 离心 10min。 4) 取滤液 200µL，用 200µL 稀释缓冲液 B 稀释， 混匀、取 50uL 用于检测。 稀释倍数：22 6.4 复合饲料 1) 称取 1.0g 粉碎样品于 50mL 离心管中，加 10mL 甲醇及 5.0g 无水硫酸钠，多功能旋转振荡器振 荡提取 10 分钟。 2) 2）4000r/min 离心 10min。 3) 取上清 1.0 mL 于氮吹仪下吹干（50 °C）。 4) 加入 1 mL 水，1.0 mL 正己烷复溶（涡旋混匀）。 5) 取滤液 200µL，用 200µL 稀释缓冲液 A 稀释， 混匀、取 50uL 用于检测。 稀释倍数：20 6.5 猪毛 1) 称取0.1g粉碎样品于具塞试管中，加2mL 0.2M 盐酸提取液，100°C 温育 10min，多功能旋 转振荡器振荡提取 10 分钟。冷却至室温。 2) 将 1mL 提取液转入离心管中，加 10mL 乙酸乙 酯涡旋 30S。 3) 室温下 3000r/min 离心 5min。 4) 取上清 5.0 mL 于氮吹仪下吹干（40 °C）。 5) 加入 500µL 稀释缓冲液 A 复溶。 稀释倍数：20 7． 酶联免疫分析程序 7.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 7.2 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取50μL标准品和样品分别加至相应的微孔 （双孔）中，各微孔中加入50μL 酶标抗原， 再各加入50μL抗体，避光，在室温温育30min。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入250μL 稀释好的洗 涤液于酶标振荡器上振荡30s（或者手工振荡）， 重复操作四次，洗完后用力在吸水纸上拍干。 4) 每孔加入150μL显色底物，室温避光温育 10min。 5) 每孔加入50μL 终止液。 6) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 8. 结果计算 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以标准浓度与所获得的各标准点和样品的平 均百分吸光度值值做 log-logit（B/B0 ）回归。相对 应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用稀释后的复溶液进行稀释。 9. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要使用不 同批次的试剂盒，这样会引起测定误差。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 10. 检测方法灵敏度、准确度、精密度 1) 试剂盒灵敏度: 0.1ppb。 2) 试剂盒变异系数：小于 20%。 3) 试剂盒准确度：克伦特罗回收率 70％-110％之 间，沙丁胺醇回收率 70％-120％之间。

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