iElisaT-2 毒素检测试剂盒

1. 概要 T2 毒素（T2）是由多种镰刀菌产生的一种霉菌 毒素。主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其 制品，对人类健康及畜牧业构成了较大危害。T-2 毒素主要影响血液，肝脏，肾脏，胰腺肌肉及淋巴 细胞的功能，T-2 毒素中毒后的一般临床症状为厌 食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍 等。使用 T2 毒素试剂盒则能够快速而准确的分析 样品中 T2 毒素残留。 2. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 偶联抗原。分别加入T2毒素标准品或样品、抗体和 酶标二抗于微孔中，样品/标准品竞争结合抗体，酶 标二抗可与一抗结合而于酶标版上的包被抗原结 合。反应洗涤后，加入TMB底物显蓝色，加入终止 液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在450nm处检测，吸 光值与样品中T2毒素含量成负相关，与标准曲线比 较即可得出T2毒素的含量。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有抗原的96微孔板：1块（96 孔，12条×8 孔） 2) T2毒素标准品：0 ng/ml、0.5 ng/ml、 1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) T2抗体 1 瓶 ×10ml 4) 酶标抗体 1 瓶 ×10ml 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 6) T2稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50ml 7) T2稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50ml 8) 显色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 终止液： 1 瓶 × 7ml 10) 试剂盒说明书： 1 份 11) 质检报告： 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —样品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 纯水，混匀。 5. 样品处理 5.1 谷物（玉米、小麦、高粱、大米、大豆）： 1） 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 30 分钟（或使用高速均质器均质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟）。 2） 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 500μl T2 稀释缓冲液 A，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：30 5.2 饲料： 1) 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 30 分钟（或使用高速均质器均 质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟）。 2) 将提取液用普通滤纸过滤，用 0.22μm 有机系 滤膜过滤后，取 50μl 滤液置于 1.5ml 离心管中， 加入 500ul T2 稀释缓冲液 B，用涡旋混合器混 匀。 稀释倍数：30 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根据实验所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用纯水、或蒸馏水、去离子 水） 2) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 浓缩液+90 ml 纯 水, 可以用于 32 孔的检测）。 6.3 测定程序 1） 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2） 分别吸取50μl 标准品和样品加至相应的微孔 （双孔）中，然后再各加入50μl的酶标二抗， 后加入50μl的T2抗体，装入袋中密封，室温 （25℃）温育15min。 3） 倒出孔中的液体，每孔加入250μl 稀释好的洗 涤液洗涤，重复操作四次。洗板时每次间隔30s， 洗完后用力在吸水纸上排干。 4） 每孔加入100μl显色底物，避光室温（25℃）温 育10min。 5） 每孔加入50μl终止液，混匀。 6） 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1）所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的 平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以 T2 毒素标准品浓度值（ppb）为 X 轴，百分 吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每一个 样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归 方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软 件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 试剂盒的性能指标 1) 检测限 LOD: 谷物 10ppb(μg/kg)，饲料 20ppb， （LOD：空白样品测定值+2 倍标准偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 15ppb，饲料 20ppb。 3) 定 量 检 测 范 围 ： 谷 物 15-600ppb ， 饲 料 20-600ppb。

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