iElisa 黄曲霉毒素 M1检测试剂盒

iElisa 黄曲霉毒素 M1检测试剂盒

1. 概要 黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲 霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性. 黄 曲霉毒素 M1 是黄曲霉毒素 B1的代谢产物。经摄入 含有黄曲霉毒素 B1饲料的奶牛产出的牛奶中，其中 便含有黄曲霉毒素 M1。由于黄曲霉毒素 M1 相当稳 定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉 毒素 M1 不仅要在饲料原料中检测，而且在终产 品中的含量也需要进行测定。 黄曲霉毒素 M1 的检测方法有高效液相色谱法 (HPLC)，薄层层析法(TLC)和酶联免疫吸附法 (ELISA)等。 用 iElisa 黄曲霉毒素 M1快速检测试剂盒可以准 确地检测牛奶、酸奶、奶酪和奶粉中的黄曲霉毒素 M1。 2. 原理 本产品是利用抗体-抗原免疫反应检测原理建 立的一种定量检测试剂盒。加入黄曲霉毒素M1 （AFLA M1）标准品或样品后，黄曲霉毒素M1与微 孔中的抗体相结合。洗去没有结合的黄曲霉毒素 M1，加入酶标抗原，与黄曲霉毒素M1与抗体没有 结合的部位相结合。洗去没有结合的酶标抗原，加 入TMB底物显蓝色，加入终止液后颜色由蓝变黄， 用酶标仪在450nm处检测，吸光值与样品中黄曲霉 毒素M1含量成负相关，与标准曲线比较即可得出黄 曲霉毒素M1的含量。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔） 2) 黄曲霉M1标准品：0 ng/mL 、0.05 ng/mL、 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/Ml： 1 瓶 × 1.0mL 3) AF-M1酶标抗原： 1 瓶 × 15mL 4) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50mL 5) AF-M1稀释缓冲液 1 瓶 × 50mL 6) 显色底物液： 1 瓶 ×12mL 7) 反应终止液： 1 瓶 × 13mL 8) 试剂盒说明书 9) 质控报告 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μL-200μL 单道，100μL-1000μL 单道, 50μL-300μL 八道 —高速离心机 —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —振荡器 —蒸发设备、恒温箱 —100mL 量筒 —计时器 —天平：感量 0.01g —离心管 1.5mL、50mL 2）试剂 —甲醇、正庚烷、二氯甲烷 5. 样品处理 5.1 牛奶： 1) 取牛奶1.0 mL样品，用离心机（4000RPM）离 心10min.。 2) 离心后用移液器*去除上层奶油。 3) 取200μL下层脱脂牛奶，加入200μLAF-M1稀释 缓冲液（1:1）稀释。 稀释倍数：2 5.2 酸奶： 1) 取酸奶样品2.0g，用离心机（4000RPM）离心 10min 。（如没有冷冻离心机，可将样品先冷 却到10℃，再离心） 2) 离心后，取200μL上层澄清液于1.5mL离心管 中，加入200μL AF-M1稀释缓冲液（1:1）稀释， 涡旋混合器混匀。 稀释倍数：2 5.3 奶粉： 1) 用天平称取2.0g奶粉到锥形瓶中，再加入10ml 50℃左右的纯水（还原牛奶）。 2) 用力振荡3min.，使充分溶解。 3) 按照5.1牛奶样品处理步骤进行。 稀释倍数：10 （检测范围：0.5---5 ppb） 5.4 奶粉（高灵敏度）：1) 用天平称取2.0g奶粉到锥形瓶中，再加入5ml 50℃左右的纯水（还原牛奶）。 2) 用力振荡3min.，使充分溶解。 3) 按照5.1牛奶样品处理步骤进行。 稀释倍数为5（检测范围：0.25---2.5 ppb） 5.5 奶酪： 1) 用天平称取2.0g粉碎的奶酪放入离心瓶中，加 入40.0mL二氯甲烷，充分溶解混匀后，剧烈振 荡15min.。 2) 过滤，取10.0mL，60℃氮气吹干。 3) 分别加入0.5mL甲醇、0.5mL PBS、1.0mL庚烷， 复容。 4) 3000转/分钟离心15min.。 5) *去除上层庚烷。 6) 取100μL下层提取液于1.5mL离心管中，加入 400μL AF-M1稀释缓冲液（1:4）稀释，涡旋混 合器混匀，取100μL用于检测。 稀释倍数：10 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后 使用。（例如：取 10 mL 浓缩液+90 mL 纯水, 可以 用于 32 孔的检测）。 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 分别吸取100μL 标准品和样品加至相应的微 孔（双孔）中,，加盖，室温温育50min.。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μL 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 4) 每孔加入AF-M1酶标抗原100μL，加盖，室温 温育30min.。 5) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μL 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 6) 每孔加入100μL显色底物液，加盖，室温温育 10min.。 7) 每孔加入50μL 反应终止液。 8) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参考波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值） 7. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以黄曲霉标准品浓度值（ppb）为 X 轴，百分 吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每一个 样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归 方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软 件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用阴性牛奶样品进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 检测方法灵敏度、准确度、精密度 1）试剂盒灵敏度: 0.05ppb 2）检测范围：牛奶 0.1---1.0 ppb酸奶 0.1---1.0 ppb 奶粉 0.5---5.0ppb；0.25---2.5 ppb 奶酪 0.5---5.0ppb 3）试剂盒变异系数：小于 20%。 4）试剂盒准确度：回收率范围在70%-110%之间。