iElisa 卡那霉素检测试剂盒

iElisa 卡那霉素检测试剂盒

1. 概要 卡那霉素是氨基糖甙类抗生素, 被广范应用于 动物疾病的治疗，由于其具有神经毒性和肾脏毒 性，损害第 8 对脑神经，导致前庭和耳蜗损伤，肾 毒性主要表现为近端身曲管损伤，出现蛋白质尿、 血尿、肾功能减退等。目前，ELISA 检测方法作为 卡那霉素残留检测的筛选方法已被广泛使用。 本试剂盒是应用 ELISA 研发的新一代药物残留 检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、 准确和灵敏度高等特点,操作时间仅需 30 分钟，能 大限度地减少操作误差和工作强度。 2. 原理 本试剂盒采用直接竞争 ELISA 方法，在酶标板 微孔条上预包被卡那霉素抗体，样本中残留的卡那 霉素将和酶标抗原竞争包被在酶标板上的抗卡那 霉素抗体，用 TMB 底物显色，样本吸光值与残留 物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘 以其对应的稀释倍数，即可得出待检中卡那霉素的 含量。 3. 试剂盒组成 1) 包被有抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔） 2) 卡那霉素标准品： 0 、0.2、0.5、1.0、3.0ng/ml 1 瓶× 1.0ml 3) KAN酶标抗原： 1 瓶 × 15ml 4) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 5) 稀释缓冲液： 1 瓶 × 50ml 6) 显色底物： 1 瓶 ×13ml 7) 终止液： 1 瓶 × 7ml 8) 试剂盒说明书 9) 稀释孔板： 1块（96 孔） 10) 质检报告 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器 20μl～200μl，100μl～1000μl —25ml 锥形瓶或 50ml 离心管 —8 道微量移液器 —酶标板振荡器 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —蒸馏水 —pH7.4 PBS 溶液 —0.1mol/mL HCl、0.1 mol/mL NaOH 5 溶液的配制 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用去离子水稀释 10 倍后使用（1 份浓缩洗涤液加 9 份蒸馏水）。 6. 样品处理 6.1 牛奶样品 1) 取 10 mL 牛奶样品于 50 mL 离心管中，4000 r/min 离心去蛋白。 2) 去除上层脂肪，吸取 20μl 中间层置于 1.5ml 离 心管中，加入 980μlKAN 稀释缓冲液，用涡旋 混合器混匀。 3) 取样品稀释液 50μL 于 ELISA 进行检测。 稀释倍数：50 6.2 动物源性食品（猪肉，猪肝，牛肉等） 1) 称取匀浆后的样品 5g，加入 20mL 样品提取液 （pH7.4 PBS 溶液），摇床振荡 30min。 2) 静置 1min，3000/min 离心 10min。吸取 50μl 取上清液于 1.5ml 离心管中，加入 450μl KAN 稀释缓冲液, 用涡旋混合器混匀。 3) 取样品稀释液 50μL 于 ELISA 进行检测 稀释倍数：40 6.3 冻干药品 取 10mg 样品，用 1ml 样品复溶液复溶样品，用 0.1 mol/mL HCl 或 0.1 mol/mL NaOH 调整溶液 pH 值在 6.0-8.0 之间，取 50μl 检测。 稀释倍数：1 6.4 血液样品 取血浆过夜（4℃）, 4000r/min 离心 10 分钟， 取上清液，用稀释缓冲液按 1：19 的比例离心后上清液 （吸取 50μl 过滤液，加入 950μl 稀释液缓冲 液）。 稀释倍数：20 7． 酶联免疫分析程序 7.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有孵育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 7.2 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的稀释孔板放 于板架上。 2) 将同等数量的包被有抗体的微孔板插入另一 板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下 标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋 封好置 2-8℃冷藏保存。 3) 分别吸取 75μl 标准品和样品加至相应的空的 微孔（双孔）中，然后各加入 75μl 的 KAN 酶 标抗原（可用排枪），将移液器调至 100μl，每 孔混匀 5 次后，吸取 100μl 混合的溶液，加入 到包被有抗体的酶标板架中（可用排枪），在 37℃温育 30min（每个标准和样品必须使用新 的吸头）。 4) 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍 打以保证*除去孔中的液体，然后每孔加入 250μl 稀释好的洗涤液洗涤，振荡后倒出孔中 的液体，拍干；重复操作四次，洗板时每次间 隔20s，洗完后用力在吸水纸上排干。 5) 每孔加入100μl显色底物，37℃避光温育10min。 6) 每孔加入50μl 终止液，混匀。 7) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 8. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以卡那霉素准品浓度值（ppb）为 X 轴，百分 吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每一个 样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归 方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软 件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用 pH7.4 PBS 进行稀释。 9. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或 搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起 灵敏度降低。 6） 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 10. 检测方法灵敏度、准确度、精密度 1) 试剂盒灵敏度: 0.2ppb 2) 试剂盒变异系数：小于 20%。 3) 试剂盒准确度：回收率范围在 70％-120％之 间。