iElisa 喹乙醇检测试剂盒

iElisa 喹乙醇检测试剂盒

1. 概要 喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育 灵，由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，对大多 数动物有明显致畸作用，对人也有潜在的三致性， 即致畸形，致突变，致癌。因此喹乙醇在美国和欧 盟都被禁止用作饲料添加剂。《中国兽药典》(2005 版)也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养 殖。 2. 原理 本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法检测等样 本中的喹乙醇，在微孔条上预包被上偶联抗原，利 用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进 行的，样本中的喹乙醇和微孔条上预包被偶联抗原 竞争抗喹乙醇抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底 物显色，样品中的喹乙醇含量与样品的吸光度值呈 反比，与标准曲线比较即可得出喹乙醇含量。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96 孔，12条 ×8 孔） 2) 黄曲霉毒素B1标准品：0 ng/ml、0.5 ng/ml、 2.0ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml、50ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) 喹乙醇抗体 1 瓶 ×10ml 4) 酶标二抗 1 瓶 ×10ml 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 6) 稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50ml 7) 稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50ml 8) 显色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 终止液： 1 瓶 × 7ml 10) 试剂盒说明书： 1 份 11) 质检报告： 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —氮气吹干仪 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —离心机 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —样品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 纯水，混匀。 —纯水（蒸馏水、去离子水）、正己烷、三氯甲烷、 甲醇 5. 样品处理 5.1 谷物类（玉米、小麦、大麦、大米、大豆）： 1） 称取 5.0g 粉碎(20 目过筛)的谷物类样品于 50mL 离心管中，加入 25.0mL 纯净水提取液， 60℃水浴 10 分钟，而后置于旋转摇床上旋转振 荡提取 10 分钟(或用高速均质器均质 1 分钟， 或用手剧烈振荡 5 分钟)，用定性滤纸过滤。 2） 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 400μl 稀释缓冲液 A， 用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：25 5.2 饲料类： 1) 称取 5.0g 粉碎(20 目过筛)的饲料样品于 50mL 离心管中，加入 25.0mL 纯净水提取液，60℃ 水浴 10 分钟，而后置于旋转摇床上旋转振荡 提取 10 分钟(或用高速均质器均质 1 分钟，或 用手剧烈振荡 5 分钟)，用定性滤纸过滤。 2) 将提取液用普通滤纸过滤，取 100μl 滤液置于 1.5ml 离心管中，加入 400μl 稀释缓冲液 B，用 涡旋混合器混匀。 稀释倍数：25 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制:水要用纯水、或蒸馏水、去离子 水 2) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 浓缩液+90 ml 纯 水, 可以用于 32 孔的检测）。 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 标准品或样品分别加至相应的微孔 （双孔）中，然后各加入 50μl 喹乙醇抗体，加 盖，在 37℃温育 30 分钟（每个标准品和样品 必须使用新的吸头）。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μl 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 4) 再加入 100μl 酶标抗体，加盖，37℃温育 30 分钟（每个标准品和样品必须使用新的吸头）。 5) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μl 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 6) 每孔加入100μl显色底物TMB，室温避光温育 10分钟。 7) 每孔加入50μl 终止液。 8) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1）所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的 平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以喹乙醇标准品浓度值（ppb）为 X 轴，百分吸 光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样 品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方 程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件， 更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用提取液进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 试剂盒的性能指标 1) 检 测 限 LOD: 谷 物 10ppb(μg/kg) ，饲料 10ppb(μg/kg)。（LOD：空白样品测定值+2 倍标 准偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷 物 12.5ppb(μg/kg) ， 饲 料 12.5ppb(μg/kg)。 3) 定量检测范围：谷物 12.5-2500ppb，饲料 12.5-2500ppb。