iElisa 玉米赤霉醇检测试剂盒 

iElisa 玉米赤霉醇检测试剂盒 

2. 概要 玉米赤霉醇（zeranol，ZER），属于雷索酸内酯 类非甾体同化激素。ZER 作为牛羊促生长剂，以耳 根埋植的形式应用，促进蛋白质的合成，能提高胴 体瘦肉率及饲料转化率。但是，玉米赤霉醇具有弱 雌激素作用，在动物尿液中的残留会引起人体性机 能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱 导下，还可能致癌。ZER 排出动物体外后，还可经 饮水和食物造成二次污染及环境污染。1998 年欧盟 禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖， 我国农业部第 235 号公告明确规定玉米赤霉醇禁用 于所有食品动物，所有可食动物尿液不得检出。 3. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 抗抗体。加入玉米赤霉醇（ZER）标准品或样品、 酶标抗原和抗体后，游离的玉米赤霉醇与酶标抗原 竞争结合抗体，抗体或抗体结合物与固定在微孔板 上的抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗原 及抗体被洗去，加入 TMB 底物显蓝色，加入终止 液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在 450nm 处检测，吸 光值与样品中玉米赤霉醇含量成负相关，与标准曲 线比较即可得出玉米赤霉醇的含量。 4. 试剂盒的组成 1) 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条 ×8 孔） 2) 玉米赤霉醇标准品：0 ng/ml 、0.5ng/ml、 2.0ng/ml、5.0ng/ml、15.0ng/ml、50.0ng/ml； 1 瓶 × 1.0ml 3) ZER酶标抗原： 1 瓶 ×10ml 4) ZER抗体： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 6) 复溶液 1 瓶 × 30ml 7) 稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50ml 8) 稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50ml 9) 稀释缓冲液C: 1 瓶 ×50ml 10) 显色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 11) 终止液： 1 瓶 × 7ml 12) 试剂盒说明书： 1 份 13) 质检报告： 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g —吹干器 —匀质器 2） 试剂 —样品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 纯水，混匀。 —纯水（蒸馏水、去离子水） —吹干器 —匀质器 5. 样品处理 5.1 牛肉样品： 1） 称取1.0g匀质肉样，加入2ml去离子水,加入8μl 葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，水浴 37℃ 2h。 2） 取出后，加入 8ml 乙腈，振荡 20min。离心 3000r/min 10min。 3） 取 5ml 上清液于另一干净离心管中，加入 2ml 三氯甲烷和 6ml 正己烷，涡旋 30s，振荡 20min。 3000r/min 离心 10min。 4） 去除上层正己烷，*去除中间层与另一试管 中，吹干后，用 1ml 复溶液复容。 5） 用稀释缓冲液 A 按 1：4（5 倍稀释）的比例稀 释（吸取 100μl 复溶液，加入 400μl 稀释液缓 冲液 A）。 稀释倍数：105.2 牛奶样品 14) 取 1.0ml 新鲜牛奶，加入 8μl 葡萄糖醛酸酶/芳 基硫酸酯酶，水浴 37℃ 2h。 15) 用稀释缓冲液 B 按 1：9（10 倍稀释）的比例 稀释（吸取 50μl 样品，加入 450μl 稀释液缓冲 液 B）。 稀释倍数：10 5.3 尿液样品 1) 取 2.0ml 尿液于离心管中，室温 3000r/min， 10min，离心，取 1ml 澄清尿液于另一离心管 中，加入 10μl 葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶， 水浴 37℃ 3h。 2) 取出后加入 5ml 三氯甲烷，振荡 20min，室温 3000r/min，10min，离心。 3) 取 2.5ml 下层溶液液于一干净试管中吹干，用 1.0ml 复溶液复容。 4) 用稀释缓冲液 B 按 1：4（5 倍稀释）的比例稀 释（吸取 100μl 复溶液，加入 400μl 稀释液缓 冲液 B）。 稀释倍数：10 5.4 饲料样品 1) 称取 2.0g 粉碎样品，加入 10ml 乙腈-0.1mol/L NaOH，振荡 20min，室温离心 3000g，10min。 取 1ml 上清液，50℃，氮气吹干。 2) 用 0.5ml 三氯甲烷溶解，加入 2ml 1mol/L NaOH，振荡 10min，室温离心 3000r/min， 10min。取 1ml 上清液，加入 100μl 6M H3PO4 再加入 5ml 三氯甲烷，振荡 10min，室温离心 3000r/min，10min。取 2.5ml 下层底液，50℃ 吹干。再用 1ml 复溶液复容。 3) 用稀释缓冲液 C 按 1：9（10 倍稀释）的比例 稀释（吸取 100μl 复溶液，加入 900μl 稀释液 缓冲液 C）。 稀释倍数：200 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根据实验所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用纯水、或蒸馏水、去离子 水） 2) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 浓缩液+90 ml 纯 水, 可以用于 32 孔的检测）。 3) 0.1mol/L NaOH: 0.4g NaOH 溶解到 100ml 水中 4) 1 mol/L NaOH ：4g NaOH 溶解到 100ml 水中 5) 乙腈-0.1 mol/L NaOH：90ml 乙腈中加入 10ml 0.1M NaOH 6) 6 mol/L 磷酸：100ml 浓磷酸加入 150ml 水 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 标准品或样品分别加至相应的微孔 （双孔）中，然后各加入 50μl 的 ZER 酶标抗 原，再加入 50μl 的 ZER 抗体，加盖，在室温 温育 30 分钟（每个标准品和样品必须使用新 的吸头）。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μl 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 4) 每孔加入150μl底物，室温避光温育10分钟。 5) 每孔加入50μl 终止液。 6) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以玉米赤霉醇标准品浓度值（ppb）为 X 轴， 百分吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每 一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专 业软件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应的稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 检测方法灵敏度、准确度、精密度 1) 试剂盒灵敏度: 0.5ppb 2) 试剂盒变异系数：小于 20%。 3) 试剂盒准确度：回收率范围在 60％-120％之 间。